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El lolitrem-B es una sustancia neurotóxica causante del síndrome “ryegrass staggers” o temblor de las ballicas en bovinos, ovinos y equinos que consumen ballicas perennes (Lolium perenne L.), infectadas con el hongo endófito Neotyphodium lolii (Latch, Christensen y Samuels) Glenn, Bacon y Hanlin. Debido al creciente uso de praderas con estas especies en el sur de Chile, es necesario conocer el contenido de lolitrem-B para realizar un adecuado manejo del pastoreo y evitar la intoxicación de los animales. El objetivo de este estudio fue implementar un método para la determinación de lolitrem-B en ballicas. Para establecer el método se utilizaron muestras de ballica sin endófito que fueron liofilizadas y mantenidas en oscuridad a -18 °C. Se adicionó estándar puro de lolitrem-B y la extracción de la toxina se hizo con una mezcla de cloroformo-metanol (2:1), purificándose el extracto en columnas de silicagel 60, preparadas manualmente. Se estudiaron cinco niveles de adición de estándar, con cinco repeticiones por nivel (0,05; 0,10; 0,30; 0,60 y 1,00 mg kg^-1). El porcentaje de recuperación promedio fue de 96,6 a 99,9% y el coeficiente de variación (CV) promedio varió entre 0,9 y 5,9%. La cuantificación se hizo por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y detección por fluorescencia. El límite de cuantificación fue de 0,05 mg kg^-1. Este método, para la determinación de la neurotoxina lolitrem-B en muestras de ballica, fue implementado por primera vez en Chile. Es rápido y de bajo costo, presentando una buena precisión, exactitud y repetibilidad